Biotecnología

Testigos de las Tecnologías de la Biología Molecular y Celular

Plataforma de divulgación y debate se complementa con herramientas de trabajo en Red para que investigadores y analistas de los impactos tecnológicos puedan intercambiar opiniones.

Telos

PHAGE DISPLAY: SISTEMAS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN FAGOS

03 mayo 2016

Imagen Destacada
El avance en el estudio de la biología de los virus bacteriófagos, virus que infectan bacterias, y las ventajas que ofrece su uso como vectores llevaron al desarrollo de una técnica conocida como Phage Display. Dicha técnica se basa en la expresión de (poli)péptidos exógenos en la superficie de las partículas de fago para el posterior estudio de las interacciones de los péptidos desplegados. (Imagen de portada: Jonathan Heras/Equinox Graphics)

Pablo San Segundo

El empleo de esta técnica implica la creación inicial de una biblioteca de virus bacteriófagos. En la actualidad, están disponibles en el mercado varios tipos de vectores de diferentes fagos. Los más utilizados son los vectores derivados de bacteriófagos filamentosos (Ff) capaces de infectar enterobacterias como E.coli. Estos fagos, como por ejemplo el fago M13 o el fago F1, no tienen actividad lítica y permiten la expresión de los péptidos exógenos en el extremo Nterminal de algunas de sus proteínas de la cápside, como las proteínas pIII, pVII o pVIII. La elección de una u otra proteína depende del número de copias que se deseen y del tamaño del péptido exógeno a desplegar. Otros vectores que pueden utilizarse son los vectores derivados del fago T7 de E.coli. Este fago con actividad lítica tiene una cápside icosaédrica muy estable y robusta y una capacidad infectiva mayor que la de los fagos filamentosos. El (poli)péptido se despliega en el extremo C-terminal de la isoforma B de la proteína de la cápside del fago (proteína 10B, gp10B en la imagen), dando lugar a cápsides funcionales con el péptido insertado desplegado en la superficie.

Phage1
Imagen 1 – Estructura de los bacteriófagos T7 y M13.

Las librerías de fagos se caracterizarán por el tipo de (poli)péptidos utilizados para construirlas. Así, las librerías más frecuentes son las de péptidos de 6 a 43 aminoácidos, que se construyen insertando oligonucleótidos de secuencia al azar en el vector de un fago filamentoso. Otro tipo de librerías muy utilizado son las que despliegan regiones responsables de la unión del anticuerpo al antígeno, como son los fragmentos Fab o solamente las regiones variables (scFvs), y que se construyen mediante combinación previa de los genes que codifican las regiones variables de los anticuerpos en los linfocitos B y su posterior inserción el vector del fago. Por último, aparecen las bibliotecas de fagos T7 en las que el inserto son los cDNAs obtenidos de alguna fuente de interés. Para hacer un cribado correcto y encontrar los fagos que desplieguen (poli)péptidos que interaccionan con la diana de interés, se lleva a cabo un proceso de selección conocido como biopanning. Cada ronda de biopanning tiene cuatro fases: (1) inmovilización de la diana en un soporte; (2) unión de los fagos a la diana; (3) lavado de los fagos que no interaccionan; (4) elución de los fagos que han interaccionado. Después, los fagos eluidos se amplifican y se inicia una nueva ronda, de forma que la librería pierde diversidad pero se enriquece en el número de fagos de interés.

Phage2
Imagen 2 – Esquema del proceso de biopanning. Imagen adaptada de Krumpen L.R.H., Mori T. (2006) The use of phage-displayed peptide libraries to develop tumor-targeting drugs. International Journal of Peptide Research and Therapeutics. 12: 79-91

La técnica Phage display tiene numerosas aplicaciones en biología molecular y biotecnología. Uno de los principales usos es el estudio de las interacciones proteína-proteína mediante la creación de librerías de péptidos al azar. También destacan las librerías de fagos con fragmentos de anticuerpos porque puede servir de alternativa a la técnica del hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales. Otras aplicaciones de las librerías de fagos serían el estudio de epítopos, el estudio de agonistas y antagonistas de receptores, estudio de nuevos fármacos peptídicos o el estudio de especificidad enzimática e inhibidores, entre otros.

Los actuales avances en esta técnica han permitido su uso para la identificación de nuevos antígenos implicados en cáncer o alergias en un proceso conocido como epitómica. El proceso consiste en la creación de una librería de fagos T7 con cDNAs de la fuente de posibles antígenos. El biopanning se realiza utilizando anticuerpos de pacientes de forma que solamente quedan retenidos los fagos que despliegan péptidos contra los que el paciente está inmunizado. Después, todos aquellos fagos que quedaron retenidos se analizan individualmente a gran escala utilizando microarrays. Tras dicho análisis, aquellos fagos que presentan mayor señal en el microarray pueden estudiarse de forma más detallada secuenciando el fragmento de cDNA insertado comparándolo con las bases de datos. Esta técnica ha demostrado ser una técnica con un fuerte potencial en el estudio de nuevos marcadores tumorales (hacia los que el paciente queda inmunizado durante el desarrollo del tumor) y en el estudio de nuevas proteínas alergénicas.

Bibliografía:

  1. Pande J., Szewczyk MM., Grover AK. (2010) Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnoly Advances 28: 849-858
  2. Hamzeh-Mivehroud M., Alizadeh AA., Morris MB., Church WB., Dastmalchi S. (2013) Phage display as a technology delivering on the promise of peptide drug discovery. Drug Discovery Today 18: 1144-1157
  3. Barbas C.F., Scott K.J., Burton R.D., Silverman J.g. (2001) Phage Display: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  4. Bratkovic, T. (2010) Progress in Phage Diplay: evolution of the technique and its applications. Mol. Life Sci. 67: 749-767
  5. Sidhu, S.S. (2000) Phage display in pharmaceutical biotechnology. Current Opinions in Biotechnology 11: 610-616
  6. Chatterjee M.,Ionan A., Draghici S.,Tainsky MA. (2006) Epitomics: global profiling of immune response to disease using protein microarrays. OMICS: A Journal of Integrative Biology 10: 499-506
  7. Babel, I., R. Barderas, R. Diaz-Uriarte, J. L. Martinez-Torrecuadrada, M. Sanchez-Carbayo, and J. I. Casal. (2009) Identification of tumor-associated autoantigens for the diagnosis of colorectal cancer in serum using high density protein microarrays. Mol Cell Proteomics 10:2382-2395.

Deja un comentario

Tu dirección de correo electrónico no será publicada. Los campos obligatorios están marcados con *