El uso de isótopos como herramientas en proteómica: TMT y su aplicación en la búsqueda de biomarcadores

27 abril 2017

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Con el avance de las nuevas tecnologías ómicas y los análisis de alto rendimiento (High-throughput) se ha acentuado la necesidad de encontrar nuevos métodos y técnicas que puedan adaptarse a las necesidades de los nuevos diseños experimentales. El número de muestras y la cantidad de datos recogidos en cada análisis ómico es muy superior a los datos generados por un análisis o experimento convencional, siendo necesario herramientas adicionales como el marcaje con algún tipo de etiqueta de las muestras a analizar.

Jesús Lavado García

En este sentido el marcaje de masas en tándem o TMT (Tandem Mass Tag)1 en proteómica es una herramienta novedosa con gran potencial en la búsqueda de biomarcadores.

La proteómica se basa en el estudio de las diferentes proteínas de una muestra determinada en un momento específico. Si se comparan varias condiciones se trata de proteómica comparativa. En este caso, se necesita enfrentar varios proteomas para observar cambios significativos. Para ello se parte de varias condiciones experimentales, estando compuesta cada una de varios miles de proteínas distintas. Para poder analizar todas las proteínas, se digiere la muestra usando una enzima proteolítica (tripsina)2 y los péptidos obtenidos se analizan por espectrometría de masas (MS). En el análisis, los péptidos se fragmentan (espectrometría de masas en tándem o MS/MS) y según la secuencia de aminoácidos obtenida y potentes programas de identificación, se define la lista de proteínas presentes en la muestra. Si se requiere cuantificar la cantidad de proteína, además de identificar las proteínas en cada muestra, necesitamos otras herramientas para ver cómo aumenta o disminuye una proteína concreta en cada condición. Esto genera una grandísima cantidad de datos difícil manejar. La solución es el TMT1 de los péptidos antes de fragmentarlos.

El TMT1 es un marcaje diseñado para ser utilizado conjuntamente con la espectrometría de masas. Esta ingeniosa solución se basa en añadir a todos péptidos una molécula de masa definida (229.162932 Da, Figura 1A) que cuando se fragmente por MS/MS libere para cada condición experimental un fragmento de diferente tamaño que haga de “reportero” de esa condición. Así, comparando la intensidad en el espectro de fragmentación de cada reportero, se podrán comparar las condiciones experimentales cuantitativamente.

Basándonos en esto, se tendría que diseñar una molécula inicialmente igual, que pudiera fragmentarse en tantas moléculas distintas como condiciones experimentales tuviéramos. Aquí es donde entran en juego los isótopos C13 y N15. Como puede observarse en la Figura 1B, la molécula de TMT ofrece la posibilidad de comparar hasta 10 proteomas debido a que en la zona que se fragmenta, la cual actúa de reportero, encontramos combinaciones de isótopos de carbono y nitrógeno. Esto hace que la misma molécula de 229 Da pueda generar reporteros de 126, 127, 128, 129, 130 y 131 Da. Pero va más allá, ya que debido a la altísima precisión con la que se detectan las masas (con 6 decimales, se mide en partes por millón), dentro del reportero de 127 Da, por ejemplo, se puede diferenciar si el isótopo presente es el del carbono o el del nitrógeno. Si contiene C13, el reportero liberado tendrá una masa de 127.131079 Da y si contiene N15, la masa liberada será de 127.124760 Da. La diferencia en la distribución de estos isótopos se puede ver en la Figura 1B.

La magia de esta técnica reside en que la molécula inicial es totalmente idéntica a cuanto a estructura química se refiere, permitiendo que todas las muestras se sometan a los mismos procedimientos de cromatografía, fraccionamientos, etc. Se debe programar el analizador para que tenga en cuenta la desviación de 229 Da en todos los péptidos a la hora de identificar la proteína. Cada muestra, correspondiente a cada condición, se marca con un tipo de molécula de TMT: 126, 127N, 127C,128N, 128C, 129N, 129C, 130N, 130C ó 131.

De esta manera podemos diseñar experimentos como el representado en la Figura 1C 3. Aquí tenemos 6 condiciones experimentales. Cada una se digiere por separado y se marca con un tipo de molécula de TMT. A continuación, se pueden mezclar todos los péptidos en una única muestra, con la misma cantidad de cada condición. Los péptidos se pueden mezclar ya que ahora, cada uno está marcado con la molécula que define su condición inicial y cuando se fragmente liberará un reportero único de esa condición.

Si todas las condiciones contienen el mismo proteoma, pero en distintos estados (enfermo, sano, en tratamiento, etc) se podrá analizar la tendencia de una proteína específica, viendo en qué condiciones aumenta, en cuáles disminuye… comparando los reporteros correspondientes. En la Figura 1D se puede observar el espectro de fragmentación de los reporteros. Con alta resolución, el equipo muestra el desdoblamiento de los picos correspondientes a 127, 128, 129 y 130 Da, dependiendo de la combinación de sus isótopos.

Un ejemplo de aplicación del TMT a la hora de estudiar distintos proteomas lo podemos encontrar en la Figura 2.4 Este es un ejemplo donde se han estudiado proteínas concretas de un proteoma en dos condiciones, llamadas genéricamente “proteoma A y B”. Este puede ser el ejemplo de un proteoma de individuo sano y otro de individuo enfermo para alguna enfermedad de la que se necesiten biomarcadores.

En la Figura 2A se muestran los mapas de correlación de esas proteínas dentro de cada proteoma. Así podemos formar grupos de proteínas que cambian a la vez y podemos caracterizar grupos de proteínas biomarcadoras para cada condición. Si dos proteínas cambian de la misma forma, tendrán correlación alta y se agruparán. En la Figura 2B se representan las correlaciones de estos proteomas en los distintos tipos celulares estudiados, pudiendo definir así patrones de tendencias de nuestro proteomas A y B estudiados, dentro de cada célula por separado. Esto nos da información de si el perfil de proteínas de in individuo sano está presente en un tipo celular más que en otro, ayudando a localizar la enfermedad a nivel celular.

 

Esta técnica de vanguardia se está utilizando a día de hoy para estudiar los cambios en el tejido cardiaco durante el infarto de miocardio, para la búsqueda de biomarcadores de sepsis, de fibrosis quística…entre otras muchas aplicaciones5-7 .


 

  1. ThermoFisher, TMT10plex™ Isobaric Label Reagent
  1. Wiśniewski, J. R.; Zougman, A.; Nagaraj, N.; Mann, M., Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods 2009, 6 (5), 359-62.
  2. Wu, L.; Candille, S. I.; Choi, Y.; Xie, D.; Jiang, L.; Li-Pook-Than, J.; Tang, H.; Snyder, M., Variation and genetic control of protein abundance in humans. Nature 2013, 499 (7456), 79-82.
  3. Benevento, M.; Tonge, P. D.; Puri, M. C.; Hussein, S. M.; Cloonan, N.; Wood, D. L.; Grimmond, S. M.; Nagy, A.; Munoz, J.; Heck, A. J., Proteome adaptation in cell reprogramming proceeds via distinct transcriptional networks. Nat Commun 2014, 5, 5613.
  4. Prabhu, S. D.; Frangogiannis, N. G., The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circ Res 2016, 119 (1), 91-112.
  5. Ludwig, K. R.; Hummon, A. B., Mass spectrometry for the discovery of biomarkers of sepsis. Mol Biosyst 2017.
  6. Muhlebach, M. S.; Clancy, J. P.; Heltshe, S. L.; Ziady, A.; Kelley, T.; Accurso, F.; Pilewski, J.; Mayer-Hamblett, N.; Joseloff, E.; Sagel, S. D., Biomarkers for cystic fibrosis drug development. J Cyst Fibros 2016, 15 (6), 714-723.

 

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